基因表达调控研究中主要实验技术有哪些

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基因表达调控主要实验技术有：ChIP、RIP、RNA pull-down、EMSA、Luciferase

1、 ChIP实验

通过与染色质片段共沉淀和PCR技术，在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解, 染色体分离并打碎为一定大小的片段200bp-1000bp;然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与 DNA交联的复合物, 对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联, DNA与蛋白质之间的 Schiff键水解, 释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测,获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。

2、 RIP实验

RIP技术（RNA BindingProtein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析；即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白，防止非特异性的RNA的结合，免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来，结合的RNA序列通过microarray（RIP-Chip），定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具，能帮助我们发现miRNA的调节靶点。

3 、RNA pull-down实验

使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

4 、EMSA实验

凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoreticmobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用、DNA定性和定量分析。生物素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。

5、 Luciferase实验

荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，不同的能够控制发光的生物体用不同的荧光素酶来催化不同的发光反应。

萤光生成反应通常分为以下两步：

萤光素+ ATP→ 萤光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+ PPi

萤光素化腺苷酸+ O2→ 氧萤光素+ AMP +光

荧光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中，将不同类型的细胞（骨髓干细胞、T细胞等）标记上（即表达）荧光素酶，就可以用高敏感度的CCD相机进行对动物体内进行活体观察而不会伤害到动物本身。在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出荧光，而发出的光子可以被光敏感元件，如萤光探测器或改进后的光学显微镜探测到。这就使得对包括感染在内的多种生命活动进程进行观察成为可能。

荧光素酶分析可应用于启动子研究中分析顺式作用元件和反式作用因子、药物筛选、siRNA和miRNA筛选、分泌途径及蛋白定位报告基因检测、活细胞的实时动态研究、信号转导通路分析、难转染的细胞（包括干细胞和原代细胞）的研究、RNA剪接研究。

双荧光素酶报告基因测试，是结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术。在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时，通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统，表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶，在单管中进行双荧光素酶报告基因测试，快速、灵敏、简便。其应用广泛，可同时分析多个调控元件、同时分析多个信号转导通路、单次筛选一个以上的靶点（包括脱靶效应、分析两个或多个通路之间的相互作用）。

基因编辑RAW 264.7细胞系——助力炎症以及破骨细胞生成相关研究

限制性核酸内切酶简称限制酶，是一类存在于微生物中，能识别双链DNA上特定核苷酸序列，并在识别位点及其附近切割双链DNA的脱氧核糖核酸酶。限制酶的命名来自分离出该限制酶的微生物种属的缩写。每种酶都有其特定的识别序列和切割位点。如限制酶EcoRⅠ识别如下序列，并在GA之间将DNA分子切断。 微生物种属来源不同而识别位点相同的限制酶称为同切限制酶（isoschizomer）。如HpaⅡ和MspⅠ都识别5'-GCCG-3'序列，但MspⅠ切割时不受识别序列甲基化的影响，而HpaⅡ只切割C未被甲基化的序列，不能切割C甲基化的序列。一些限制酶切割双链DNA后产生平齐的末端（blunt end），另外许多限制酶切割后在末端产生出一小段单链序列，称为黏性末端（cohesive end）。识别序列不同的限制酶可切割出相同黏性末端（compatible cohesive end）。 限制酶切割DNA的产生的片段大小，取决于该限制酶识别序列的核苷酸长度，并与被切割DNA的核苷酸组成、序列和结构特点有关。若假定DNA分子中4种脱氧核糖核苷酸的组成相等且随机排列，则限制酶切割DNA产生的片段数目及其大小，只与该限制酶识别序列的核苷酸长度有关，即被识别的序列在DNA链中出现的频率为1/4n。用识别序列为四核苷酸的限制酶切割DNA时，平均每256bp （1/44）有一个切点，或者说酶切片段的平均长度为256bp。用识别序列分别为五、六、七、八核苷酸的限制酶切割DNA时，就会依次得到平均长度分别为1024bp（1/45）、4096bp（1/46）、16 384bp（1/47）和65 536bp（1/48）的片段。在人和哺乳动物基因组DNA中，识别位点较少的限制酶称为高识别特异性限制酶或稀有切割位点限制酶（rare cutter）。 被限制酶切断的DNA片段可在DNA连接酶的作用下重新连接。这样就可以对DNA片段进行重组。另外，由于不同生物基因组的大小与核苷酸顺序的排列有很大差异，所以，不同生物种属DNA限制酶片段的长度和数目也不尽相同。因此，由限制酶片段构成的“限制酶物理图谱”可以作为不同基因组或染色体特异的结构特征。 核酸凝胶电泳 核酸凝胶电泳是使DNA或RNA分子在电场力的作用下通过凝胶，利用凝胶对不同长度核酸片段阻滞作用的差异使其分离。在电场强度设定时，所有核酸分子的电荷密度都相同，而不同长度的核酸分子在相同浓度的凝胶中迁移时受到的阻力各异，因此可以通过凝胶电泳将不同大小的核酸片段按其长度分开。选择适当的凝胶浓度可使不同范围的DNA片段得到有效的分离。提高凝胶浓度适宜分离较小的DNA片段；降低凝胶浓度可以使较大的DNA片段得到较好的分离。通常使用2%～4%的琼脂糖凝胶分离50～1500bp的DNA片段，用0. 7%～1%的琼脂糖凝胶分离1～20kb的DNA片段。但是即使使用了0. 3%～0. 5%的高强度琼脂糖凝胶也只能分离50～100kb的DNA片段，对于大于50kb的 DNA片段一般很难用普通凝胶电泳有效分离。 脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）是使DNA分子在一个定时改变方向的脉冲电场凝胶电泳系统中泳动。由于大于30kb的DNA分子在电泳时只能以阻力最小的头尾牵引方式进入胶孔匍匐蛇行，所以每改变一次电场方向，DNA分子就要相应地重新调整一次泳动方向。长DNA片段在凝胶中移动时受到的阻力大，重新定向所需的时间长，其重新定向所需的时间与DNA片段的长度成正比。这样，DNA分子越大，它在每一个脉冲时间内用于重新定向的时间越多，净迁移的时间越少，实际泳动的距离也就越短。反复改变电场方向，并通过调节脉冲时间，就可以将各种不同长度的DNA片段有效地分开。 核酸凝胶电泳广泛用于DNA片段分离、回收、物理图谱分析与RNA鉴定。经过分离的核酸片段需用啡啶溴红（溴化乙啶，EBr）染色。在波长254nm的紫外光照射下，DNA片段显示橙红色。这是因为DNA吸收254nm的紫外光后发出次级荧光，嵌合于DNA双螺旋小沟中的EBr吸收302nm和366nm的荧光、再发出波长590nm的红色可见光。RNA分子因其具有局部二级结构，所以也可用EBr染色，但检测灵敏度大大低于DNA。由于短波长紫外光对DNA。由于短波长紫外光对DNA片段有破坏作用，所以在回收DNA片段时可使用302nm或360nm的长波长紫外光直接激发EBr，以减少紫外光对DNA片段的破坏。但这会降低检测灵敏度。 DNA修饰与合成酶 DNA聚合酶催化DNA体外合成反应。这些酶作用时大多需要模板，合成出的产物序列与模板互补。大多数聚合酶优先作用于DNA模板，也可拷贝RNA，但效率较低。最常用的以DNA为模板的DNA聚合酶是大肠杆菌（E. coli）DNA聚合酶Ⅰ及其大片段（klenow片段）、T4和T7噬菌体DNA聚合酶、测序酶（sequenase），经过修饰的T7DNA聚合酶和耐热DNA聚合酶。 E. coli DNA聚合酶Ⅰ为一分子量109kD的多肽链，具有5'→3'DNA聚合酶活性，5'→3'及3'→5'外切核酸酶活性和大肠杆菌必备的RNA酶H的活性。DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）去除了DNA聚合酶Ⅰ的5'→3'外切酶活性，只保留其5'→3'DNA聚合酶活性和3'→5'外切核酸酶活性。可用于补平DNA3'的凹端，或先利用其3'→5'外切酶活性将DNA片段的3'凸出端切成凹端，再将其补平。Klenow的这一补平作用还可用于DNA片段3'末端的放射性或非放射性标记。DNA聚合酶大片段的5'→3'DNA聚合酶活性主要用于随机引物标记DNA片段、cDNA第二链合成和双脱氧末端终止法DNA测序。 耐热DNA聚合酶是一种耐热的以DNA为模板的DNA聚合酶，分子量65kD。最初是从极度嗜热的栖热水生菌中分离出来的，其最佳作用温度为72℃。目前已从多种耐热菌中分离出耐热性更好的DNA聚合酶，广泛应用于聚合酶链反应。 以RNA为模板的DNA聚合酶称为反转录酶。常用的两种反转录酶分别来自禽成髓细胞瘤病毒（AMV）和Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）。两种反转录酶在许多方面有所区别，但均无3'→5'外切酶活性。AMV反转录酶包括两条多肽链，除聚合酶活性外还具有很强的RNA酶H活性。Mo-MLV反转录酶的RNA酶H活性较弱，有利于合成较长的cDNA。AMV反转录酶的最适反应温度为42℃（鸡的正常体温），而Mo-MLV反转录酶在42℃时则迅速失活。因此，AMV反转录酶可更有效地转录具有较强二级结构的mRNA模板。二者反应时所要求的pH也有一定差异。反转录酶主要用于mRNA转录为cDNA，以便克隆、分析，或代替DNA聚合酶进行双脱氧末端终止法DNA顺序，还可用于补平5'突出的DNA片段（也可用此法标记DNA5'端）。 DNA连接酶可以催化DNA5'磷酸基与3'羟基之间形成磷酸二酯键。最常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶。T4噬菌体DNA连接酶为一分子量68kD的多肽。用于连接平端或末端互补的DNA分子以及DNA分子自身环化。是DNA重组中必不可少的工具酶。 基因克隆及主要的载体系统 DNA限制性内切酶、连接酶及其他各种修饰酶的使用，可以按照一定的设计将不同的DNA片段组装在一起，使其具有特定的功能；或者将某个基因或基因片段从复杂的基因组中分离出来。这一操作被称为DNA重组或基因克隆。 首先用限制酶将需要分离或重组的DNA剪切成一定长度的片段，经过一定的修饰，与载体DNA连接，形成重组DNA。然后将重组DNA送入单细胞微生物（通常为大肠杆菌或酵母）中，经过恢复培养，筛选出带重组DNA的菌落。 根据被重组DNA片段的长度和重组DNA的目的，可以选用不同的载体。常用的载体有质粒、λ噬菌体、黏粒、细菌人工染色体（bacteria artificial chromosome，BAC）、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）以及穿梭质粒（shuttle vector）等。 质粒是细菌中独立于细菌基因组DNA之外，能自我复制并具有稳定基因的环状双链DNA分子。天然质粒可长达数百kb，经过改造用于DNA重组的质粒一般为2～10kb。质粒中有DNA复制起始位点、外源DNA片段插入的重组位点和一定的筛选标志。将病毒DNA与质粒重组可构成既能在原核生物中扩增，又可以在真核生物中表达的穿梭质粒。含有转录起始位点等成分，可将重组DNA转录成mRNA并表达出蛋白质的质粒称为表达载体。真核细胞表达载体中除含有质粒的基本成分外，还有真核基因启动子、mRNA剪接位点、3'多聚A加尾位点以及真核细胞选择标记等。 野生型λ噬菌体DNA约48kb，其中一部分序列可被替换而不影响其裂解及生长。在λ噬菌体DNA中最多可以插入（替换）23kb外源DNA。重组DNA经噬菌体包装蛋白包装成噬菌体颗粒，以噬菌体感染的方式进入其宿主大肠杆菌，并在其中繁殖、扩增，形成蚀斑。 野生型P1噬菌体基因组约90kb，作为一个自主复制单位游离于宿主染色体之外。P1载体约30kb，在大肠菌中以质粒形式存在，含抗药性筛选标记、pBR3222质粒复制子、P1质粒复制子、P1噬菌体复制子、包装识别位点，进入宿主后重组环化的位点和一些调节重组DNA长度的填充片段。P1噬菌体载体系统可用于克隆75～110kb的外源DNA片段。 黏粒克隆是可以被包装成噬菌体颗粒的重组质粒。黏粒载体序列有5～8kb，含质粒DNA必备的复制起点、抗药性筛选标记、重组位点和将重组DNA包装成λ噬菌体颗粒所需的cos序列，因此叫做cosmid，译为黏粒或柯斯质粒。因为可被包装到λ噬菌体中的DNA片段为38～52kb，所以黏粒载体可克隆33～47kb的外源DNA片段。重组DNA经过包装，以噬菌体感染方式进入宿主菌，再环化成质粒，以质粒形式存在于宿主体内。 在质粒中克隆外源基因片段最简便，但插入片段的长度超过10kb时转化效率大大降低。λ噬菌体、黏粒和P1噬菌体克隆体系，采用将DNA包装成噬菌体颗粒后转染宿主菌的方法提高转化效率。电转化（electroporation）技术的发展为提高大质粒的转化效率创造了条件，现在已经可以构建和转化几十到二、三百kb的细菌人工染色体（BAC）克隆。 由具有完整着丝粒、端粒和自主复制顺序功能的DNA片段组成的人造酵母染色体（YAC），在酵母细胞的有丝分裂和减数分裂过程中具有与天然酵母染色体一样的稳定性。YAC载体中有酵母的着丝粒、自主复制顺序成分、可用作端粒的TEL序列，以及筛选含YAC的酵母菌株时使用的选择标记。YAC载体可插入200～1000kb的外源DNA片段，用于克隆大片段外源DNA。YAC克隆有序排列构成的物理图谱是基因克隆和DNA序列分析的基础。含完整基因位点，包括位点控制区、启动子、全部结构基因序列，表达调节信号的YAC，还可作为研究基因簇功能以及定点整合的对象，进行转基因动物实验。 分子杂交 DNA双螺旋结构是由两条序列互补的多核苷酸链接碱基配对原则以氢键结合而成。在一定条件下，如酸碱度、加热或有机溶剂的存在，可以破坏DNA双链的氢键结合将两条链分开，这一过程称为变性。变性时只破坏氢键，不涉及共价键的断裂。变性DNA两条彼此分开的链在适当条件下重新缔合成双链的过程叫做复性。在实验过程中任何两条来源不同的核苷酸链，只要各自具有一部分可以互补的序列即可形成氢链结合，产生异源双键。因此，将具有一定互补序列的核酸单链，在液相或因-液体系中按碱基酸对原则，结合成异源双链的过程称为分子杂交。DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA，以及人工合成的寡聚核苷酸链与DNA或RNA之间，只要具有一定的互补序列均可发生杂交。分子杂交可用于检测基因结构的改变、mRNA的表达、重组DNA的筛选等。被检测的核酸分子称为靶基因或靶序列；用于探测靶基因（或其表达产物）的具有一定可检测标志的已知序列称为分子探针。 探针所携带的标志物可以是放射性同位素（3H、14C、35S、32P、33

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）被认为是巨噬细胞的最佳模型之一，因为该细胞能够进行胞饮和吞噬作用，在炎症、免疫、凋亡、肿瘤研究应用广泛。RAW264.7细胞在体外可以对刺激产生反应，并随后产生具有破骨细胞完全分化的特征的多核细胞，被广泛用于研究骨骼疾病如风湿性关节炎、骨质疏松症、骨质溶解、牙周炎等。

RAW264.7是单核细胞/巨噬细胞样细胞系，源自BALB/c 微小核糖核酸的Abelson白血病病毒转化细胞系。RAW 264.7是破骨细胞、炎症研究最常用的体外模型之一。

1.?破骨细胞生成研究：

RAW 264.7已被证明在RANKL诱导下容易分化为破骨细胞。与原发性破骨细胞前体不同，RAW 264.7的分化无需添加巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）。

2.?炎症研究：

RAW264.7是筛选抗炎活性物和研究炎症最常用的体外研究模型。在诱导剂（如脂多糖LPS）的作用下，RAW264.7细胞会模拟炎症反应，释放或上调多种炎症介质如一氧化氮（NO）、环氧合酶-2（COX-2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）等。

据报道，类风湿关节炎(RA)影响着全世界2100多万人。RA是一种影响关节的自身免疫性炎症疾病。它的特征是巨噬细胞和淋巴细胞浸润，滑膜成纤维细胞增殖，最终的关节破坏。巨噬细胞在RA发病机制中发挥重要作用。RA炎性滑膜中巨噬细胞数量高于正常关节，与关节疼痛和炎症的严重程度呈正相关。许多药物已经被批准用于治疗风湿性关节炎，基因或细胞疗法。

MicroRNA 155 (miR-155)在小鼠16号染色体和人类21号染色体的BIC基因中被发现。在临床和实验模型中，miR-155与RA的发病机制有关，因为它在RA患者的滑膜和滑膜液巨噬细胞中上调。siRNA干扰miR-155 (KD)可以抑制促炎细胞因子的产生。miR-155参与RA形成的机制可能是多方面的，其中之一是miR-155靶向Src同源性-2的3个未翻译区域，其中包含肌醇磷脂酶1 (SHIP1)，炎症的负调节因子。因此，RA中升高的miR-155导致SHIP1水平降低，导致促炎细胞因子的产生升高。

研究者利用CRISPR/CAS9技术成功突变小鼠巨噬细胞RAW264.7内源性miR-155基因，获得miR-155基因组敲除(GKO)克隆 。进一步分析表明，在LPS刺激下，miR-155 GKO克隆表达更高水平的SHIP1，但产生较少的促炎细胞因子。

通过使用miR-155 GKO克隆，去除miR-155会导致巨噬细胞产生促炎细胞因子的减少，从而证实了之前的观察，即升高的miR-155有助于RA患者细胞因子产生的持续水平。通过将miR-155模拟物转染回GKO克隆，研究者能够重新引入miR-155效应。总之，这些结果表明，内源性miR-155基因的突变可能导致pre-miR-155产物被截断，无法成熟为更短但稳定的miR-155。

NLR家族蛋白NLRP3是外源性病原体和内源性损伤相关分子模式(DAMPs)的胞质传感器。NLRP3激活后，与适配器蛋白ASC和半胱氨酸蛋白酶caspase-1组装，形成NLRP3炎性小体，导致caspase-1的裂解和激活。活化的capase-1裂解IL-1的细胞因子和IL-18的前体，使其成熟，并导致几种促炎细胞因子的释放，包括IL-1的细胞因子和IL-183。据报道，NLRP3炎症小体在多种炎症疾病的发生和发展中起重要作用。抑制NLRP3炎症小体信号已被证明在减轻败血性休克、腹膜、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、T2D、多发性硬化、和痛风等疾病中有效。因此 NLRP3炎性小体是治疗多种炎性疾病的一个极好的靶点 。

利用CRISPR/Cas9在基因组水平上直接破坏关键分子-NLRP3，不仅可以完全抑制NLRP3炎症小体的激活，还可以避免抑制抗炎生物制剂和抑制剂的脱靶途径的潜在风险。 研究CRISPR/Cas9敲除NLRP3的策略有望成为治疗多种炎症性疾病更有效的方法 。

在这项研究中，研究者报道了一个系统的传递系统CRISPR/cas9?将mCas9和gNLRP3封装进CLAN中。CLAN是一种以PEG -b- PLGA为基础的纳米颗粒，辅以阳离子脂质BHEM - Chol，用于核酸治疗的递送。在之前的工作中，研究者们已经将小干扰RNA、RNA适配体和乙肝病毒CpG导入肿瘤细胞、心肌细胞、巨噬细胞或浆细胞样树突状细胞CLAN。

然而，mCas9/gNLRP3不同于其他核酸疗法，纳米颗粒的性质影响给药效率。为检测CLAN42是否能有效递送mCas9/ gRNA，研究者将Cas9和增强绿色荧光蛋白(EGFP)共表达mRNA (Cas9-EGFP mRNA，或mCas9-EGFP)及阴性对照gRNA (gNC)封装到选择的CLANs(CLANmCas9-EGFP/gNC)中。用不同的CLANmCas9- EGFP/gNC转染骨髓源巨噬细胞(BMDMs)。转染组EGFP阳性的BMDMs百分比最高。接下来，研究者通过转染稳定表达GFP (Raw264.7-GFP)的Raw264.7细胞(巨噬细胞系)和包裹mCas9和gRNA靶向GFP (gGFP)的CLAN(CLANmCas9/gGFP)检测基因敲除效率。转染组中gfp敲除(KO) Raw264.7-GFP细胞比例最高，达53.9%。研究者通过向小鼠注射不同的CLANmCas9- EGFP /gNC进一步证实了CLAN42的体内mCas9/gRNA传递效率。注射组EGFPpositive腹膜巨噬细胞的百分比最高(48.4%)。综上所述， 由于其巨噬细胞摄取能力最强，所以在mCas9/gRNA传递中，CLAN42是最有效的，并且CLAN42更适合包封mCas9/gNLRP3(记为CLAN mCas9/gNLRP3 )用于多种炎症性疾病的治疗 。

因此，研究者通过调整聚合物中阳离子脂质BHEM-Chol的重量和PEG5K-b-PLGA11K的质量分数，建立了不同表面电荷和PEG密度的基团库。研究者在体外和体内都筛选了家族，并选择了一个更好的家族来将mCas9/gNLRP3导入巨噬细胞中，通过破坏巨噬细胞中的NLRP3来改善脓毒症休克，mCas9/gNLRP3诱导的腹膜炎和HFDinduced T2D。研究为CRISPR/Cas9进入巨噬细胞和治疗多种炎症性疾病提供了一个有前景的策略。

研究结果证明了CLANmCas9/ gNLRP3是一种很有前途的治疗NLRP3依赖性炎症性疾病的方法。研究也为通过纳米颗粒介导的免疫细胞基因编辑治疗免疫相关疾病提供了一个范例。

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